La ruptura abierta con la autoridad de Galeno, la disección de cadáveres como fundamento de la enseñanza de la Anatomía, así como la investigación anatómica, fueron aportaciones centrales del movimiento de reforma de la Anatomía encabezado por el flamenco Andrés Vesalio (1514-1564). Formado en París y Lovaina, pasó más tarde a Venecia y Padua. De formación galenista con la tutela de Silvio pasó con los años a ser el principal crítico y detractor de la Anatomía de Galeno.
Vesalio al ser nombrado en 1537 profesor de Anatomía y Cirugía en Padua instauró un nuevo tipo de enseñanza de la Anatomía basado en el estudio más directo y personal. Al pie de la mesa de disección se cuidaba de practicar él mismo un cuidadoso y detallado examen del cadáver, explicando a sus alumnos el resultado de lo que observaba. Mediante la práctica seriada de la disección de cadáveres humanos observó que los hechos descubiertos en sus disecciones estaban en desacuerdo con las descripciones dadas por Galeno.
En 1543, y aprovechando las posibilidades que le ofreció el hecho de ocupar la Cátedra de Anatomía en Padua, publicó “De Humanis Corporis Fabrica”. Esta obra conmocionó al mundo científico por la crítica sistemática que hacía de los errores anatómicos de Galeno. De Humanis Corporis Fabrica establece el comienzo de la moderna ciencia e investigación basada en la observación. El tratado está dividido en siete secciones. La primera trata acerca del sistema esquelético, la segunda de los músculos y ligamentos, la tercera del sistema circulatorio, la cuarta de los nervios periféricos y “cerebrales”, la quinta de los órganos abdominales, la sexta de los órganos torácicos, y la séptima del encéfalo, de los “órganos de los sentidos especiales”, de la disección cadavérica humana y la experimentación animal.
Vesalio no sólo corrigió los errores de Galeno, sino que señaló que algunos de ellos se debían a que el médico de Pérgamo se había servido de los animales para sus estudios anatómicos. Frente a las posturas críticas de Vesalio sobre la obra de Galeno se levantó una reacción defensora de la Anatomía galénica basada en libelos encabezada por Silvio, el antiguo maestro de Vesalio.
Durante la segunda mitad del siglo XVI el movimiento vesaliano se extendió a buen número de Universidades europeas, aunque su núcleo central estaba radicado en Italia. No obstante, en España también se reprodujo el enfrentamiento entre galenistas y vesalianos, de tal modo que defensores de Galeno se postularon figuras como Laguna, Lovera, o Montaña, mientras que la escuela Valenciana, formada por Luis Collado y Pedro Ximeno, discípulo de Vesalio, fue después de Padua la seguidora de las nuevas corrientes anatómicas propuestas por Vesalio.
Otro anatomista contrario a la Anatomía de Galeno fue Miguel Servet, compañero de Vesalio, quien se distinguió por ser el primero que describió la circulación de la sangre en los pulmones, expuesta en su libro “Christianismi Restitutio” (1553). En esta época, cabe destacar también como seguidor de Vesalio a Juan Valverde de Amusco, autor de diversos descubrimientos como el hueso estribo, también atribuido a Pedro Ximeno, así como del mejor tratado anatómico postvesaliano, “Historia de la composición del cuerpo humano” publicado en el año 1556.
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